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详细信息

【免疫平台】免疫共沉淀(Co-IP)

  实验原理

免疫共沉淀( Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 X 的抗体免疫沉淀 X,那么与 X 在体内结合的蛋白质 Y 也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

免疫共沉淀的优缺点

优点:
(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;
(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;
(3)可以鉴定一种特定蛋白质的作用搭档;
(4)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点:
(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;
(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;
(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。


实验流程

(1)收集新鲜的细胞悬液,用PBS洗涤细胞2次,4℃、1000 rpm离心5-10 min收集细胞;
(2)加入适量细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂),彻底将细胞沉淀分散并悬浮,冰上裂解30 min,4℃、12000 rpm离心10-15 min收集上清;
(3)将上清转移到一新的离心管中,以备蛋白浓度测定及后续实验;
(4)测定细胞裂解液(收集上清)中蛋白总浓度;
(5)取一离心管,加入适量的上清液和相应的抗体(适当比例),混匀。在4°C缓慢振荡孵育过夜,以形成免疫复合物;
(6)取适量protein A或protein G或protein A/G 琼脂糖磁珠,用适量裂解缓冲液洗3次,每次3000 rpm离心3 min;
(7)将预处理过的琼脂糖磁珠加入到盛有抗原抗体复合物的离心管中,4°C 缓慢振荡孵育
2-4 h,使抗体与琼脂糖磁珠偶联;
(8)免疫沉淀反应后,4°C、3000 rpm 离心 5-10 min,将琼脂糖磁珠离心至管底,除去未结合的样品,保存以备分析;
(9)向离心管中加入适量的裂解缓冲液洗 3-4 次,离心收集磁珠弃上清;
(10)向离心管中加入适量电泳上样缓冲液,沸水煮 5 分钟,保留含有抗原的上清;
(11)取部分用于SDS-PAGE分析,余下置于-20℃保存。


注意的问题
(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂;
(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用;
(3)可以选择使用对照抗体,如单克隆抗体:正常小鼠的 IgG 或另一类单抗;兔多克隆抗体:正常兔 IgG;
(4)为确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;
(5)要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;
(6)确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

实验周期与费用

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