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详细信息

【细胞平台】TUNNEL检测细胞凋亡

 实验原理

对不同组织切片先增加细胞膜通透性,然后让 rTDT 和生物标记的 dTUTP 进入细胞内,在 rTDT 的辅助下 dTUTP 与核断裂的 DNA 3』-OH 结合,再用 HRP 标记的链霉亲和素与 dTUTP 上的 biotin 结合(每个链霉亲和素至少可以再结合 3 个 biotin 分子),最后用 DAB、过氧化氢与 SP 上的辣根过氧化物酶 HRP 发生氧化、环化反应,形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色,最终通过计数每张切片上不同视野中 TUNEL 阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。

关键步骤

1. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先 60ºC 20 min,再用使用二甲苯两次 5-10 min;而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗,这些以便后面的结合反应充分、均匀;

 

2. 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄,选择蛋白酶 k 的孵育时间,常用 10-30 min,几 μm 切片用短时间;几十 μm 切片用长时间,通过摸索达到既不脱片,有能够使后面的酶和抗体进入胞内。

 

3. 适当延长 TUNEL 反应液的时间。一般是 37ºC 1 h,你也可以根据你的凋亡损伤程度,选择更长的时间,可长至 2 h,但要结合你最终的背景着色。

 

4.DAB 显色条件的选择。一般 DAB 反应 10 min 左右,结合镜下控制背景颜色,最长不超过 30 min;promega 公司提供的 DAB 液(桃红色),不利于辨认棕褐色,我不太喜欢。

 

5.PBS 的充分清洗。 

 

6.  内源性 POD 的封闭 。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织,可适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度,可以达到很好的封闭效果,且不影响最终的特异性染色。

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